Bagaimana sampel swab diproses untuk deteksi Covid 19 dengan RT-PCR?

Mengenal Real Time PCR

Real time polymerase chain reaction atau sering disebut quantitative polymerase chain reaction (qPCR), merupakan suatu metode biologi molekuler berbasis reaksi rantai polimerase.

Metode ini mendeteksi amplifikasi gen target selama proses PCR berlangsung, tidak di akhir reaksi, seperti pada PCR konvensional. qPCR menggunakan fluoresens, dimana peningkatan sinyal fluoresens menunjukkan terjadinya amplifikasi gen target selama proses PCR.

Deteksi qPCR

(a) deteksi berbasis SYBR green. SYBR green berikatan dengan semua DNA utas ganda dan menghasilkan sinyal fluoresens.

(b) deteksi berbasis probes. Jika probe utuh, tidak ada sinyal yang dideteksi/tidak ada gen target. Jika primer dan probe menempel pada gen target kemudian enzim Taq polymerase mensintesis utas baru DNA, maka enzim 5′ eksonuklease akan bekerja memecah probe sehingga pada akhirnya dihasilkan sinyal fluoresens.

Peningkatan sinyal fluoresens ini menunjukkan terjadinya amplifikasi gen target.

Beberapa catatan :

1. Jika material genetik dari target adalah RNA, maka RNA diubah dulu menjadi cDNA sebelum dilakukan PCR. Langkah ini disebut reverse transcription (RT).

2. RT dapat dilakukan dengan one-step (RT dan amplifikasi dilakukan sekaligus dalam mesin PCR) atau two- step (dibuat cDNA dulu dalam suatu tabung sebelum dilakukan PCR).

3. qPCR singleplex: hanya 1 gen target yang diamplifikasi per reaksi. Probe gen target diberi fluoresens tertentu

4. qPCR multiplex: lebih dari 1 gen target yang dideteksi per reaksi. Probe masing-masing gen target diberi fluoresens yang berbeda sehingga dapat dibedakan gen mana yang diamplifikasi.

5. Saat melakukan qPCR: kontrol negatif, kontrol positif, kontrol internal dirunning bersamaan dengan sampel

6. Kurva amplifikasi pada hasil qPCR kontrol positif dan sampel yang positif akan berbentuk sigmoid

7. Ct (cycle threshold) value atau Cq menunjukkan jumlah siklus yang diperlukan sinyal fluoresens untuk melewati ambang/threshold. Ct value berbanding terbalik dengan jumlah  target DNA pada sampel (Ct value yang rendah menunjukkan jumlah target DNA yang besar).

Alur Pemeriksaan Swab

Pre- analisis :

• Pengecekan identitas Pencatatan
• Pengkodean
• Penyimpanan

Analisis :

• Alikuot sampel
• Ekstraksi RNA
• Pencampuran reaksi PCR
• PCR

Post-analisis : 

• Interpretasi hasil PCR
• valid-> input hasil
• invalid-> ulang proses analisis
• Input data hasil di sistem
• Verifikasi hasil
• Pengiriman hasil

Dalam format PowerPoint bisa diunduh disini.